Real-time PCR (RT-PCR) atau biasa disebut juga Quantitative PCR (qPCR) merupakan salah satu teknologi yang umum digunakan dalam analisis genetik. Dibandingkan dengan PCR konvensional, analisis genetik dengan RT-PCR memungkinkan pengerjaan lebih cepat dan analisis data secara langsung tanpa perlu analisis lanjutan dengan elektroforesis agarosa. Sementara jika dibandingkan dengan Next Generation Sequencing (NGS), analisis genetik dengan RT-PCR cenderung lebih tertarget (hanya terfokus pada gen yang ditarget) sehingga teknologi ini cenderung lebih murah, lebih mudah dan lebih cepat.
Gambar 1. Instrumen RT-PCR HC Scientific TechCyler 384
Di Indonesia sendiri, RT-PCR telah digunakan untuk berbagai aplikasi. Dalam bidang pangan RT-PCR digunakan untuk analisis halal (analisis DNA babi) dan Analisis Food Adulteration (membedakan daging sapi asli dan oplosan). Di bidang klinis, RT-PCR digunakan untuk diagnosis berbagai penyakit seperti Covid-19, TB, dan Infeksi Menular Seksual (IMS). RT-PCR juga dapat digunakan untuk penentuan viral load dalam memonitor kondisi pasien dan efektivitas pengobatan terapi antiretroviral (ARV) pada pasien HIV.
Dalam bidang Aquaculture dan Agriculture, RT-PCR dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit pada hewan laut dan tanaman. Selain itu, RT-PCR juga dapat digunakan untuk Genotyping yaitu analisis gen tertentu untuk memperkirakan sifat fenotip yang akan muncul. Genotyping dapat menjadi dasar seleksi dalam proses Molecular Breeding atau pemuliaan. Dengan melakukan pengujian Genotyping, peneliti dapat menghemat biaya dan meminimalisasi kerugian akibat hasil panen / budidaya yang tidak sesuai.
BOTTLENECK DALAM ANALISIS RT-PCR
Walaupun analisis menggunakan RT-PCR memiliki waktu analisis yang lebih singkat dibandingkan metode lain, namun RT-PCR juga memiliki keterbatasan yang sama dengan berbagai metode analisis genetik lain, yaitu hanya dapat menganalisis sampel dalam bentuk DNA. Sebagai akibatnya sebelum dilakukan analisis RT-PCR, sampel harus dipreparasi terlebih dahulu.
Adapun preparasi untuk analisis RT-PCR biasanya terdiri dari beberapa tahap. Tahap pertama adalah Homogenisasi dan Lisis Sel yaitu tahap untuk menghancurkan jaringan atau sel sehingga DNA akan mudah diekstrak. Dilanjutkan dengan tahap berikutnya adalah proses Ekstraksi DNA yaitu tahap mengekstrak DNA dan memisahkan DNA dari komponen lainnya.
Gambar 2. Tahapan ekstraksi DNA
Seringkali tahap preparasi di atas menjadi Bottleneck atau tahap penentu laju karena masing-masing proses masih bersifat manual sehingga memakan waktu cukup lama. Semakin banyak sampel, semakin banyak pula waktu yang harus dialokasikan untuk preparasi sampel. Belum lagi jika terjadi kegagalan pada salah satu tahap akan mempengaruhi hasil analisis RT-PCR.
AUTOMATIC & HIGH THROUGHPUT RT-PCR PREPARATION INSTRUMENTS
Untuk mengatasinya, PT Alphasains Dinamika menyediakan solusi berupa instrumen preparasi dan RT-PCR dari HC Scientific yang bersifat otomatis dan High-Throughput sehingga dapat mempreparasi lebih banyak sampel sekaligus secara otomatis dengan kualitas hasil yang terjamin. Adapun instrumen yang tersedia terdiri dari :
- High-Throughput Tissue Grinder TurboGrinder 5760
Gambar 3. HC Scientific TurboGrinder 5760
TurboGrinder 5760 dapat digunakan untuk menghancurkan 576 sampel jaringan sekaligus secara otomatis. Instrumen ini menggunakan teknologi vibrasi vertikal frekuensi tinggi (70Hz) dengan media khusus yang memungkinkan proses penghancuran lebih konsisten dan menghasilkan sampel yang hancur sepenuhnya dengan bentuk yang lebih seragam.
Gambar 4. Hasil grinding menggunakan TurboGrinder 5760
Instrumen ini dapat menghomogenisasi berbagai tipe sampel seperti jaringan tanaman (dapat berupa akar, batang, daun, bunga, buah, biji), jaringan hewan, ragi, sel kultur mamalia dan sel bakteri. Selain untuk homogenisasi sebelum ekstraksi DNA, alat ini juga dapat digunakan sebelum isolasi protein.
- Automated Nucleic Acid Extraction System MagC9600 dan MagC384
MagC9600 dan MagC384 merupakan Automated Nucleic Acid Extraction System yang dapat digunakan untuk ekstraksi DNA / RNA dari berbagai sampel seperti Whole Blood, swab, plasma, serum, jaringan hewan maupun jaringan tanaman. Kedua instrumen ini menggunakan teknologi magnetic bead dan semua proses ekstraksi (pengikatan, pencucian maupun elusi) dilakukan secara otomatis. Instrumen ini bersifat open platform dapat dikombinasikan dengan berbagai merk KIT ekstraksi berbasis Magnetic Beads yang tersedia di pasaran. Instrumen ini dilengkapi juga dengan HEPA Filter yang dikombinasikan dengan UV Sterilizer untuk mencegah terjadinya kontaminasi.
Gambar 5. HC Scientific MagC9600 dan MagC384
MagC9600 dapat digunakan untuk ekstraksi DNA hingga 96 sampel secara simultan sementara MagC384 dapat digunakan untuk ekstrasi DNA hingga 384 sampel secara simultan. Selain untuk ekstraksi DNA, kedua instrumen ini juga dapat digunakan untuk library purification untuk NGS, enrichment serta pemurnian patogen.
- 384-Well Real Time PCR System TechCycler 384Q
Setelah preparasi dilakukan secara otomatis dan simultan, sampel DNA dapat dianalisis menggunakan Real Time PCR TechCycler 384Q yang memungkinkan analisis 384 sampel secara simultan. Instrumen ini juga memiliki 5-channel fluorescence yang memungkinkan untuk multiplexing sampel hingga 5 parameter sekaligus.
Gambar 6. HC Scientific TechCycler 384Q
- High Throughput Genotyping GeneMathematica
Untuk jumlah sampel harian yang sangat banyak contohnya untuk pengujian Genotyping, bottleneck atau tahap penentu laju bukan hanya berasal dari tahap preparasi saja namun juga dari tahap RT-PCR terutama proses pencampuran DNA dengan master mix PCR serta pengolahan data yang jika dilakukan secara manual seringkali menghabiskan banyak waktu. Kedua proses tersebut dapat diotomasi menggunakan GeneMathematica System dari HC Scientific.
Gambar 7. HC Scientific GeneMathematica
GeneMathematica System terdiri dari tiga unit instrumen dan satu software yaitu HCSCI Arrayer, HCSCI Cycler, HyperScanner dan software Mathematica Master.
HCSCI Arrayer adalah Automated Workstation yang dapat melakukan duplikasi sampel, pencampuran reagen, pencucian pipet dan penutupan plate dalam satu mesin secara presisi dan cepat. Instrumen ini dapat mengisi 384 well plate dalam waktu 3 menit dan secara total dapat digunakan untuk 50,000 reaksi selama 8 jam kerja. HCSCI Cycler adalah Automated High-Throughput Water Bath Thermal Cycler yang memungkinkan PCR Cycling secara simultan untuk 25 x 384 Microwell Plate. Proses PCR Cycling di HCSCI Cycler menghilangkan tahap pemanasan dan pendinginan sehingga waktu reaksi menjadi lebih cepat dibandingkan PCR konvensional. HyperScanner adalah Automated High-Throughput Fluorescence Scanner yang didesain untuk scanning hasil PCR secara cepat, akurat, sensitif dan presisi. Waktu pembacaan dengan HyperScanner hanya 20 detik untuk setiap 96-microplate dan mampu membaca fluorescence dengan volume sampel 1 μL.
Setelah proses pencampuran, Thermo Cycling dan Scanning Fluorescence, analisis data dalam jumlah besar dapat dibantu dengan Software MathematicaMaster. Dengan software ini, user dapat melakukan pengeditan protokol, melakukan pelabelan pada sampel atau reagen dan yang terpenting menganalisis data dalam jumlah banyak. MathematicaMaster memungkinkan untuk clustering analysis dari raw data yang biasa dibutuhkan dalam genotyping untuk kemudian dapat dieksport ke CSV, SNP Viewer, Cluster Plot dan lainnya.
Gambar 8. HC Scientific GeneMathematica Workflow
Dengan adanya berbagai instrumen yang bersifat otomatis dan High Throughput dari HC Scientific, analisis RT-PCR akan menjadi lebih mudah, lebih cepat, tetap akurat, presisi dan sensitif.
Alphasains Dinamika merupakan distributor peralatan laboratorium seperti RT-PCR System, Automatic Cell Counter & Live Cell Imaging, Lipid Nanoparticle Synthetizer, Automatic Peptide Synthetizer, FTIR, Raman, Oil & Grease Extractor, GC, GC-MS, Digital Microscope, dll yang memiliki keagenan beberapa brand dari berbagai negara di dunia, baik Asia, Amerika maupun Eropa. Beberapa brand diantaranya adalah HC Scientific, NanoEntek, Precigenome, Thermo Scientific, OSS , DeltaPix dan lainnya. Untuk informasi lebih lanjut mengenai produk kami, silahkan kunjungi www.alphasains.com atau email ke sales@alphasains.com.