HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) merupakan teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diamnya berupa cairan atau padatan. Dalam HPLC ini menggunakan tekanan tinggi untuk mengirim fasa gerak ke dalam kolom. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Berikut ini merupakan komponen dalam HPLC.
Kolom HPLC
Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus dengan panjang antara 3 – 15 cm pada dinding bagian dalam terkadang dilapisi dengan material inert. Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik (catridge) atau terbuat dari stainless.
Kolom pada HPLC merupakan bagian yang sangat penting. Karena pemisahan komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.
Pemilihan Kolom
Pemilihan kolom merupakan langkah yang utama untuk penggunaan kromatografi. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performa kromatogram. Maka ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yaitu :
- Tetapkan tujuan pemisahan. Tentukan apakah aplikasi yang akan dilakukan membutuhkan resolusi tinggi, waktu analisis singkat, maksimum sensitivitas, waktu hidup kolom yang panjang, biaya operasional yang rendah, atau faktor lainnya
- Menyamakan kolom yang digunakan untuk analit lain yang serupa.
- Melakukan studi literatur terhadap metode yang akan dilakukan.
Jenis-jenis kolom HPLC
| Jenis Kolom | Panjang (cm) | Diameter (mm) | dp (um) |
| Konvensional | 10 – 25 | 4,6 | 10 |
| Microbore | 10 | 2,4 | 5 |
| High Speed | 6 | 4,6 | 3 |
Ada beberapa jenis kolom HPLC yang dapat digunakan sesuai kebutuhan, namun pada pengaplikasiannya yang paling banyak digunakan adalah jenis kolom HPLC dengan jenis konvensional yang secara umum digunakan di berbagai bidang baik itu bidang farmasi, lab service, research, F&B, dan bidang lainnya.
Kromatografi dengan kolom konvensional mempunyai fasa diam normal yang bersifat polar. Sedangkan fasa geraknya bersifat non-polar, sehingga analit yang akan dipisahkan adalah analit yang bersifat non polar. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada kolom yang polar dibandingkan dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
Mekanisme Kerja di Dalam Kolom
Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen canpuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat interaksinya dengan fasa diam (kolom) akan keluar dari kolom lebih lama.
Cara Maintenance Kolom
Ada banyak faktor yang harus diperhatikan dalam penggunaan kolom agar dapat berfungsi dalam kondisi baik dalam waktu yang panjang. Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam maintenance kolom yaitu :
- Kualitas Pelarut
- Larutan pencuci kolom
- Pelarut untuk menyimpan kolom
- Penggunaan Pre Column
Princeton merupakan brand dari USA yang menyediakan berbagai pilihan LC Column sesuai kebutuhan. Mulai dari C8,C18, ODS, Diol, Cyano, SIlika dan masih banyak lagi. Dengan variasi ukuran yang sesuai dengan kebutuhan analisis. LC column yang sering digunakan adalah C8 dan C18 dengan ukuran 10cm, 15cm dan 25cm.
Perbedaan Kolom C8 dan C18
Kolom C8 adalah bentuk kolom yang ada di beberapa peralatan HPLC, dan memiliki Octylsilane sebagai fase diamnya. Kolom C8 menunjukkan waktu retensi yang rendah. Selain itu, analit terelusi lebih cepat di kolom ini. Karena fase diamnya kurang rapat. Kolom C18, di sisi lain, juga merupakan bentuk kolom yang kami gunakan dalam peralatan HPLC, tetapi memiliki Octadecylsilane sebagai fase diamnya. Lebih penting lagi, kolom ini menunjukkan waktu retensi yang tinggi. Selain itu, analit terelusi perlahan di kolom ini. Hal ini karena fase diam padat yang tinggi. Infografis berikut menyajikan perbedaan detail antara kolom C8 dan C18 sebagai perbandingan berdampingan
| C8 Column | C18 Column | |
| Definisi | Kolom C8 adalah bentuk kolom yang ada di beberapa peralatan HPLC, dan memiliki Octylsilane sebagai fase diamnya. | Kolom C18 adalah bentuk kolom yang kami gunakan dalam peralatan HPLC yang memiliki Octadecylsilane sebagai fase diamnya. |
| Fasa Diam | Fasa diam kolom C8 mengandung Octylsilane. | Fasa diam kolom C18 mengandung Octadecylsilane. |
| Waktu Retensi | Kolom C8 menunjukkan waktu retensi yang rendah. | Kolom C18 menunjukkan waktu retensi yang tinggi. |
| Atom Karbon | Jumlah atom karbon pada kolom C8 adalah 8. | Jumlah atom karbon pada kolom C18 adalah 18. |
| Elusi | Analit terelusi lebih cepat di kolom C8. | Analit terelusi lebih lambat di kolom C18. |
| Tingkat Hidrofobik | Fasa diam C8 memiliki hidrofobik yang rendah. | Fasa diam C18 memiliki hidrofobik yang tinggi. |
| Densitas | Kolom C8 memiliki fase diam yang kurang padat. | Kolom C18 memiliki fase diam padat. |
| Pergerakan senyawa non polar. | Senyawa nonpolar bergerak ke bawah kolom dengan cepat | Senyawa nonpolar bergerak ke bawah kolom secara perlahan. |
Application Notes LC Column Princeton
Berdasarkan beberapa application notes diatas, analisis beberapa senyawa dengan HPLC menggunakan LC Column Princeton menunjukkan hasil peak (puncak) spektrum yang diperoleh sangat jelas menunjukkan beberapa komponen dalam senyawa tersebut.
PT. Alphasains Dinamika merupakan distributor peralatan laboratorium yang memiliki keagenan beberapa brand dari berbagai negara didunia, baik Asia, Amerika maupun Eropa. Beberapa brand diantaranya adalah Thermo Scientific (US), Young In Chromass (Korea Selatan), OSS (US), Princeton (US) dan lainnya. Untuk informasi lebih lanjut mengenai produk kami, silahkan kunjungi www.alphasains.com atau email ke sales@alphasains.com.
Referensi:
- Choudhary, Ankur. 2011, “Perbedaan antara Kolom C8 dan C18 yang Digunakan dalam Sistem HPLC.” Pedoman Kefarmasian, Pedoman Kefarmasian, Jakarta
- Bughis, 2013, “Catatan Kimia”, Jakarta