Metabolomik merupakan ilmu yang mempelajari sekelompok atau keseluruhan metabolit dalam suatu organisme. Metabolit merupakan senyawa berukuran kurang dari 1500 Da, dapat berupa metabolit endogenous (yang diproduksi oleh organisme tersebut) maupun exogenous (yang berasal dari luar organisme seperti kontaminasi bahan kimia, toxin, dan lainnya). Metabolit endogenous dapat berasal dari hasil atau intermediet proses metabolisme seperti peptida, asam amino, asam nukleat, vitamin, senyawa fenol dan berbagai small-molecule biomarker. Saat ini penelitian ke arah metabolomik telah digunakan untuk mempelajari toksikologi, penemuan obat, kanker, manipulasi genetic, natural products, makanan dan sebagainya.
Berbagai teknologi telah digunakan dalam analisis Metabolomik diantaranya adalah Mass Spectrometry (LC-HRMS dan GC-MS) serta NMR. Teknologi LC-HRMS biasa digunakan untuk Metabolomics Profiling yaitu untuk mengetahui kandungan berbagai metabolit dalam suatu sampel. Dengan bantuan pemisahan kromatografi cair untuk mengurangi kompleksitas sampel serta kemampuan deteksi dari High-Resolution Mass Spectrometry, LC-HRMS dapat membedakan berbagai jenis metabolit berdasarkan massanya. Teknologi GC-MS (Gambar 1) juga dapat digunakan untuk Metabolomics Profiling, biasanya dikhususkan untuk senyawa yang mudah menguap atau dapat diderivatisasi menjadi senyawa mudah menguap. Sementara NMR biasanya digunakan untuk sampel yang tidak terlalu kompleks (cenderung murni atau campuran yang terdiri dari sedikit senyawa) untuk memetakan struktur molekul dari senyawa metabolit tertentu. Ketiga teknologi di atas sangat powerful dalam analisis Metabolomik namun memiliki kekurangan seperti waktu analisis yang lama dan membutuhkan preparasi sampel yang rumit dan cukup menyita waktu.
Gambar 1. Young in Chromass GC-MS
Selain ketiga instrumen di atas, teknologi Molecular Spectroscopy seperti FTIR, Near IR dan Raman Spectroscopy dapat digunakan untuk analisis Metabolomik secara lebih cepat, high-throughput, dan dengan minimum preparasi sampel. Kelebihan lain dari teknologi Molecular Spectroscopy (disebut juga Vibrational Spectroscopy) diantaranya adalah memiliki keberulangan yang tinggi, dapat digunakan untuk pengujian in-situ, dapat mendeteksi berbagai metabolit dengan cakupan yang luas (excellent coverage) dan dalam beberapa kasus dapat dilakukan pengujian secara langsung (tanpa preparasi) baik untuk sampel berbentuk cair maupun padatan (Cebi, 2023). Dengan bantuan teknik pengolahan data secara Chemometrics, ketiga instrument di atas dapat digunakan untuk mencari similarities atau kemiripan, membuat klasifikasi dan diferensiasi, serta melihat pengaruh suatu perlakukan terhadap kadar berbagai metabolit secara kuantitatif.
Berikut akan dijelaskan masing-masing aplikasi dari ketiga Instrument Molecular Spectroscopy di atas:
1. FTIR : Reliable Metabolic Fingerprinting Technique
Gambar 2. Thermo Scientific Nicolet APEX FTIR
FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy atau biasa juga disebut sebagai Mid Infrared Spectroscopy, Gambar 2) telah digunakan dalam Analisis Metabolomik karena kemampuannya untuk memberikan informasi komposisi dan struktur kimia dari suatu senyawa secara detail. FTIR dapat melakukan Metabolomics Fingerprinting berdasarkan karakter gugus fungsi pada suatu sampel. Dengan kemampuan ini, FTIR dapat membedakan dengan jelas dua atau lebih sampel selama terdapat perbedaan atau terjadi perubahan gugus fungsi.
Metabolomics Fingerprinting dengan FTIR memiliki kelebihan diantaranya adalah high-throughput, cost-effective, mudah, serta tanpa atau minimum sample preparation. Analisis dengan FTIR ini juga dapat dilakukan pada berbagai cairan tubuh tanpa menggunakan reagen atau preparasi tambahan. FTIR juga sangat efektif, cepat dan memiliki ketahanan yang baik untuk mendeteksi produk herbal dan telah digunakan dalam pemeriksaan keaslian berbagai jenis rempah. Selain untuk Metabolomics Fingerprinting (klasifikasi dan screening sampel), FTIR juga dapat digunakan untuk Metabolomics Profiling (identifikasi dan kuantifikasi senyawa tertentu)
Salah satu contohnya adalah penggunaan FTIR Spectroscopy dalam mengevaluasi komposisi biokimia pada suatu jamur Fitopatogen Alternaria alternata akibat perlakuan dari berbagai ekstrak tumbuhan aromatik (Efstathia Skotti, 2014). Pada penelitian ini, sampel jamur A. alternata diinkubasi selama 3 hari masing-masing dengan berbagai ekstrak tumbuhan aromatic (C. sativus, H. officinalis, M. officinalis, O. dictamnus, O. vulgare, dan S. officinalis). Kultur jamur A. alternata kemudian dianalisis menggunakan Thermo Scientific FTIR Nicolet 6700 Spectrometer dengan Mode DRIFTS (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy).
Spektrum FTIR kemudian dianalisis dengan software Omnic dan TQ Analyst. Terlihat pada Gambar 3, perlakuan dari ekstrak tumbuhan yang berbeda akan memberikan luas area khususnya pada bilangan gelombang yang berkorelasi dengan Lipid, Amida dan Karbohidrat. Data tersebut kemudian dianalisis lebih lanjut secara statistika dengan Teknik PCA (Principal Component Analysis) untuk pengelompokkan dan klasifikasi.
Gambar 3. Hasil analisis FTIR pada kultur A. alternata setelah ditambahkan ekstrak berbagai jenis tumbuhan aromatik.
2. FTNIR : Rapid Monitoring of Compositional Quality Properties
Gambar 4. Thermo Scientific FTNIR Antaris II Analyzer
FTNIR (Gambar 4) atau Fourier Transform Near Infrared merupakan spektroskopi inframerah yang menggunakan sumber cahaya pada daerah Near Inframerah (kisaran 12500 – 4000 cm-1 atau 800 – 2500 nm). Berbeda dengan FTIR yang biasanya digunakan untuk senyawa yang cenderung murni atau tidak terlalu kompleks (analisisnya berfokus pada satu atau sedikit jenis senyaw), FTNIR memiliki kemampuan untuk menganalisis banyak senyawa secara simultan bahkan dalam suatu sampel dengan kompleksitas tinggi (banyak campuran).
Sebelum digunakan, FTNIR harus diperkenalkan dengan senyawa yang ditarget dengan variasi konsentrasi (data konsentrasi didapat dari pengujian primer seperti Kjeldahl untuk protein, gravimetri untuk kadar air, dan lain-lain). Dengan bantuan Multivariate Data Anaylisis atau Chemometrics, data tersebut kemudian dibuat menjadi suatu pemodelan yang dapat digunakan untuk memprediksi konsentrasi atau memperkirakan kualitas dari suatu sampel unknown secara cepat dengan tanpa atau minimum preparasi sampel.
FTNIR telah digunakan untuk menguji berbagai metabolit dalam matriks makanan. Sebagai contoh FTNIR telah digunakan untuk menganalisis berbagai jenis kunyit yang berasal dari 4 daerah geografis yang berbeda yaitu daerah Sangli, Erode, Allepey, dan Lakadong (amreen Khan, 2023). Setelah digerus, masing-masing bubuk kunyit dianalisis dengan Thermo Scientific Antaris II FTNIR Analyzer yang dilengkapi interferometer dan integrating sphere. Range spektrum yang digunakan adalah 10,000 – 4,000 cm-1 dengan waktu analisis hanya 60 detik.
Hasil FTNIR menunjukkan perbedaan spektrum antara berbagai kunyit dari masing-masing daerah geografis (Gambar 5A). Dengan bantuan Teknik Chemometrics PCA (Principal Component Analysis), kunyit dari berbagai geografis dapat dikelompokkan (Gambar 5B). Hasil pengelompokkan ini ke depannya dapat digunakan untuk memprediksi daerah geografis kunyit untuk sampel unknown atau memastikan keaslian kunyit dari suatu daerah geografis tertentu.
Gambar 5. Hasil FTNIR terhadap berbagai kunyit dari 4 daerah geografis berbeda.
Selain untuk pengelompokkan, data dari FTNIR juga dapat digunakan untuk memprediksi kandungan berbagai bahan aktif yang memiliki aktivitas farmakologi seperti Curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin. Dengan menginput data analisis konsentrasi dari HPLC untuk ketiga senyawa tersebut per geografis dan dengan bantuan Teknik Chemometrics PLS-DA (Partial Least Square Discriminant Analysis), didapatkan pemodelan untuk memprediksi kadar ketiga senyawa dalam masing-masing geografis kunyit dengan akurasi 99-100% dan reliability sebesar 98-100%. Pemodelan ini dapat digunakan untuk memprediksi kadar ketiga bahan aktif di dalam sampel kunyit unknown secara cepat.
3. Raman Spectroscopy : In-situ and Real-Time Mapping
Gambar 6. Thermo Scientific DXR Raman
Raman merupakan Teknik Molecular Spectroscopy yang lebih powerful dan dengan sensitivitas lebih tinggi. Tidak seperti kedua metode sebelumnya yang menggunakan sumber cahaya Inframerah, Raman menggunakan laser dan memanfaatkan fenomena hamburan cahaya terutama hamburan Raman (Raman Scattering).
Raman memiliki beberapa kelebihan diantaranya dapat menguji dari luar packaging (baik kemasan plastik maupun kaca) dan juga tidak terpengaruh oleh keberadaan air. Tidak seperti FTIR dan FTNIR yang cenderung terbatas pada senyawa organic dan polar, Raman justru sangat powerful untuk senyawa organic non-polar, carbon-based material bahkan untuk senyawa anorganik.
Raman yang dikombinasikan dengan Mikroskop disebut Raman Mikroskop mampu meningkatan kemampuan Raman untuk menganalisis senyawa dengan ukuran kecil seperti sel hingga ukuran 1µm. Teknologi Raman Mikroskop yang lebih advance, yaitu Raman Mikroskop Imaging memungkinkan untuk melakukan mapping dan imaging pada suatu sistem biologi secara Real-time.
Di bidang Metabolomics, Raman terutama Raman Mikroskop telah digunakan dalam analisis metabolit terutama untuk pengujian In-Situ (analisis metabolit langsung dilakukan pada sumbernya / tidak perlu dilakukan ekstraksi). Sebagai contoh Raman Mikroskop telah digunakan untuk memonitor kondisi bakteri pathogen C. jejuni setelah diberikan perlakuan berbagai konsentrasi antibiotik ampicillin (Ma, Chen, Chou, & Lu, 2021). Berdasarkan perubahan Raman band pada daerah asam nukleat, protein, lipid, peptidoglikan dan asam lemak tak jenuh, dapat dimonitor konsentrasi inhibisi antibiotik terendah maupun ketika terjadi resistansi.
Gambar 7. Spektrum Raman untuk bakteri C.jejuni dengan perlakuan berbagai konsentrasi antibiotik
Sementara untuk Raman Mikroskop Imaging dapat digunakan untuk Real-time atau Live Analysis, salah satunya untuk biochemical mapping sel tumor viable di dalam media (Lita A, 2018). Analisis menggunakan Thermo Scientific DXR 2xi Raman Microscope Imaging dengan laser 780 nm mampu memvisualisasikan pelepasan cytochrome C dari mitokondria dan dapat digunakan untuk kuantifikasi kandungan lemak pada sel tumor selama ditambahkan obat sekaligus mapping dan kuantifikasi kerusakan DNA pada sel.
Berbagai aplikasi di atas, merupakan sedikit contoh dari aplikasi Molecular Spectroscopy Technology dalam bidang Metabolomics secara cepat, mudah dan minimum preparasi. Tertarik dengan teknologi Molecular Spectroscopy (Thermo Scientific) maupun aplikasinya di bidang Metabolomics, silahkan menghubungi sales@alphasains.com.
Alphasains Dinamika merupakan distributor peralatan laboratorium seperti FTIR, Raman, Oil & Grease Extractor, GC, GC-MS, Digital Microscope, dll yang memiliki keagenan beberapa brand dari berbagai negara di dunia, baik Asia, Amerika maupun Eropa. Beberapa brand diantaranya adalah Thermo Scientific (US), OSS (US), DeltaPix (Denmark), Young In Chromass (Korea Selatan), dan lainnya.